可應用於蛋雞產業之胚胎性別辨識方法(上)

雞肉與雞蛋是全球最普遍且主要之蛋白質來源之一。根據聯合國糧農組織（FAO）之數據，2023年全球雞蛋產量約達1.03億噸，較前一年增長1%[1]。未來數年，隨著人口增加、收入提高以及健康意識之增強，全球對雞蛋之需求將持續增加，於2028年全球雞肉市場預計將達到4,291.1億美元[2]。然而，於家禽產業中，公雞因為無法產蛋且其肉質不受一般消費者歡迎而缺乏商業用途[3]。因此，一旦孵化出生，公雞幼雛便被淘汰，主流淘汰方式為機械粉碎法與二氧化碳窒息法[4]。淘汰日齡幼雛引發了倫理與經濟雙重問題，已開發國家之消費者更傾向於選擇來自對動物友善之食品生產方法[5]，而業者則將公雞淘汰視為經濟負擔，因為需待幼雛孵化後才能淘汰。因此，於歐洲部分國家，如德國、法國及義大利，興起了倡導符合經濟成本效益且尊重動物之家禽產業發展議程，德國更從2022年初起便立法全面禁止公雞淘汰[6]。

目前家禽產業有三種適用於幼雛之性別辨識方法，分別為腹肛部辨識法、羽毛辨識法及第二性徵辨識法，各方法介紹如下：

1. 腹肛部辨識法：
   適用於幼雛孵化後第一天，由鑑別師將幼雛置於手中，輕輕壓低頭部後目視確認該幼雛之泄殖器。雖然這是鑑定雛雞性別最準確之方法，但需要鑑別師具備足夠經驗，以避免於鑑定過程中對幼雛造成傷害。
2. 羽毛辨識法：
   K基因（羽毛發育基因）決定，K基因位於Z染色體上（母雞為ZW，公雞為ZZ），公雛雞之羽毛生長速度快於同齡之母雛雞，因此可用來區分性別。對於缺乏K基因之蛋雞品種，則需要透過人工育種計畫與帶有K基因之種雞交配，以建立帶有該性聯基因之蛋雞品系[7]。
3. 第二性徵辨識法：
   共同飼養公母幼雛，直到出現公幼雛之第二性徵逐漸成熟後再作分類，色澤明亮且更豐滿之冠羽通常為公幼雛，然而該方法之準確度低於前述兩種方法。

以上三種方法各自存在一些瓶頸，如日齡幼雛之腹肛部辨識方法難度大，需要經驗豐富之鑑別師，因此人事成本較高；羽毛辨識法則僅適用於特定蛋雞品種；而透過第二性徵進行性別鑑定為最簡單之方法，但需要於孵化後最初幾週內將公母鳥一同飼養。考慮到飼料成本及轉換率，第二性徵辨識法之成本高於腹肛部辨識法。有鑑於相關法規問題與經濟考量，近年來已陸續出現新型早期性別辨識方法，這些方法能夠於幼雛孵化前準確地辨識胚胎性別。根據Corion等人於2023年5月之統計資料（圖1），目前該領域中相關技術專利依數量排列前5項依序為拉曼光譜及螢光分析法（Raman spectroscopy and fluorescent）、可見光及近紅外光譜分析法（Visible-Near-Infrared spectroscopy, VIS-NIR）、免疫感測分析法（Immunosensing）、無線射頻與核磁共振（Radio Frequency & Nuclear Magnetic Resonance, RF&NMR）及基因編輯生物（Genetically Modified Organism,GMO）。

圖1、卵內性別鑑定專利申請數量之累計增長圖（1993年至2023年）
資料來源：Corion Matthias, et al., 2023

專利數排序第一之拉曼光譜及螢光分析法之技術原理與近年發展情形說明如下：

拉曼光譜及螢光分析法

    2016年德國德累斯頓卡爾·古斯塔夫·卡爾斯醫學院與萊比錫大學獸醫學院合作研究團隊提出透過拉曼光譜進行禽鳥胚胎性別辨識之方法[8]。拉曼光譜為一種非破壞性光譜技術，用於分析物質之結構與分子振動。基於拉曼散射現象，當樣品受到光線激發後，會發出比入射光頻率不同之散射光。此種頻率差稱為拉曼位移，可提供有關分子結構、成分及化學鍵情況之訊息[9]。該團隊先對禽鳥胚胎之外循環血液使用發光二極管（LED）照明以增強紅血球可見度，隨後選擇直徑大於100微米大型卵黃血管進行卵內拉曼光譜測量，發現公胚胎血液中血紅蛋白濃度較高，因此於1,000至1,500 cm−1之波長區間與母胚胎有顯著差異（圖2）。此方法於孵化期第3.5天即可進行性別鑑定，且無需抽取DNA或蛋白質等生物樣本。

圖2、公胚胎及母胚胎之拉曼光譜訊號

資料來源：Galli Roberta, et al., 2016

儘管這項技術於早期檢測方面表現卓越，具有高達96%之準確率，但其需要於蛋底鑿孔，因此會影響孵化率，且分析速度仍待改善（每顆蛋需40秒檢測時間），這些因素可能為該技術尚未商業普及之原因。該技術近年被Agri Advanced Technologies（AAT GmbH，德國）取得並持續開發[10]。於2023年，原研究團隊以此方法為基礎，研發雙波長螢光光譜分析法。依次於532奈米與785奈米波長下激發卵內螢光，結果顯示母雞胚胎於560至720奈米與800至1,000奈米波長區間與公雞胚胎具顯著差異（圖3）。這項新技術將分析速度節省一半，亦即單顆蛋僅需20秒即可完成檢測，且精準度維持96%[11]，未來可望實際應用於德國及其他西歐國家之蛋雞產業。

圖3、公胚胎與母胚胎之拉曼光譜訊號激發波長λ1(532奈米)及λ2(785奈米)下，卵內螢光（I2）之平均訊號強度（μ）及標準差（δ）

資料來源：Preuße Grit, et al., 2023

結論

早期研究表明自孵化期之第7天開始，雞胚胎可能已經具有感受疼痛能力[12]。德國動物福利法預告將自2024年起進行修訂，禁止於雞蛋中之胚胎發育至第6天起進行性別鑑定並淘汰公雞胚胎。拉曼光譜分析法能夠於胚胎發育之第3.5天進行性別判定，因此於法規修訂後仍可於產業中使用。然而，目前其辨識效率仍然不及羽毛辨識法（每隻雞約0.8秒）等傳統方法[13]。若能夠建立高通量之分析程序，預期能於近年內實際應用於蛋雞孵化場。

下一篇內容將探討可見光及近紅外光譜分析法與質譜分析法等實際應用於蛋雞胚胎性別分辨之產業技術。

參考文獻

1. Gateway to poultry production and products, FAO. Accessed in August 2023.
2. Global Chicken Market, Size, Forecast 2023-2028, Industry Trends, Growth, Share, Outlook, Impact of Inflation, Opportunity Company Analysis, 2023.
3. Gautron Joel, et al. “Review: What are the challenges facing the table egg industry in the next decades and what can be done to address them?” Animal. 2021.
4. Alice Di Concetto, et al. “Chick and Duckling Killing: Achieving an EU-Wide Prohibition.” European Institute for Animal Law & Policy, January 2023.
5. Reithmayer C, Mußhoff O. “Consumer preferences for alternatives to chick culling in Germany.” Poult Sci, 2019.
6. Deutscher Bundestag. Entwurf eines gesetzes zur änderung des tierschutzgesetzes -verbot des kükentötens, 2021. Accessed in August 2023.
7. Kemsley Max. "Chicken sexing". Department of Agriculture, Fisheries and Forestry (Queensland), 2010.
8. Galli Roberta, et al. “In Ovo Sexing of Domestic Chicken Eggs by Raman Spectroscopy.” Analytical Chemistry, vol. 88, no. 17. pp. 8657–8663. 2016.
9. Dietzek Benjamin, et al. Introduction to the fundamentals of Raman Spectroscopy. In Springer series in surface sciences (pp. 47–68), 2018.
10. Galli Roberta, et al. “Sexing of chicken eggs by fluorescence and Raman spectroscopy through the shell membrane.” PloS one vol. 13,2 e0192554. 23 Feb. 2018.
11. Preuße Grit, et al. Highly sensitive and quick in ovo sexing of domestic chicken eggs by two-wavelength fluorescence spectroscopy. Anal Bioanal Chem 415, 603-613. 2023.
12. Verbot des Kükentötens：Bundeskabinett beschließt Formulierungshilfe zur Anpassung der Rechtslage ab 2024. Bundesministerium für Ernährung und Landwirtschaft, May 2023. Accessed in August 2023.
13. Chick sexing procedure for commercial poultry farming, Pashudhan Praharee, January 7, 2023.
14. Corion Matthias, et al. Trends in in ovo sexing technologies: insights and interpretation from papers and patents. J Animal Sci Biotechnol, 2023.